自制组织芯片测试GS试剂对组织抗原的保存效果

自制组织芯片测试GS试剂对组织抗原的保存效果

孙廷谊  谢红建  孔令非

河南省人民医院病理科

摘自：2013年第06期《诊断病理学杂志》

我们自制组织芯片，通过免疫组化染色，对乳腺疾病组织中vimentin的表达情况进行了回顾性检测，用来测试GS试剂对组织抗原的保存情况，取得较为满意的效果。

1.材料和方法

 1.1材料

选取河南省人民医院病理科2011年7月至12 月资料齐全的乳腺疾病存档蜡块80例，其中乳腺纤维瘤20 例，乳腺癌60例；患者术前未进行放疗或化疗。所选取的蜡 块当时均是经GS无醛固定液固定、GS系列脱水透明套液试 剂制作而成。主要仪器和试剂 Leica染封一体机，Leica- Band全自动免疫组化染色仪，GS系列试剂（哈尔滨格林标 本技术开发有限公司），vimentin(即用型）和Maxvision试剂 盒均购置于福州迈新生物技术公司，Leica机用Bond Polymer Refine Detection 染色试剂盒。

 1.2 方法

  1.2.1 组织芯片制作

用自制的取样针（内径为1.0 mm) 在蜡块上均匀地打出直径稍大于1.0 mm、间距为1.0 mm的小孔，深约2 ~3 mm，制成TMA受体蜡块。在供体蜡块上钻取一小圆柱形组织条，再将其送入受体蜡块的预留孔内，按—定规则排列方阵，如此反复就制成组织芯片蜡块。将构建 好的TMA芯片蜡块用大载玻片轻轻盖好，翻转芯片蜡块放入病理组织漂烘仪的烘片箱内，37℃，1 h，使其蜡与新插入的小圆柱状组织溶为一体，即制成含80个位点的组织芯片，于4 ℃：冰箱中保存备用。切片时组织芯片冷冻15 min以上，切片厚3 μm，65 ℃烤片，HEJHC切片烤15 min。

  1.2.2 传统HE染色

①切片经二甲苯I、II脱蜡各5 min； ②无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇各2 min，自来水洗；③苏木 精染8 min，自来水洗；④1%盐酸乙醇分化数秒钟，自来水洗；⑤PBS返蓝1 min，自来水洗；⑥1%水溶性伊红染1 min； ⑦70%乙醇、95%乙醇各10 s，无水乙醇I、II处理各2 min，二甲苯I、II各2 min，中性树胶封片。

  1.2.3 GS环保型染液HE染色

①切片经脱蜡液I处理5 min，脱蜡液I处理5 min，自来水洗2 min；②苏木精染色液 处理3 ~5 min，自来水洗10 s；③分化液2 ~3 s，自来水洗1 min；④蓝化液1 min，自来水洗1 min；⑤伊红染色液处理1 ~3 min，自来水洗3 s；⑥除浮染液3 s，沥干残余试剂；⑦除水透明液处理1 min，沥干；⑧透明液3 min，无苯封片胶封片。

  1.2.4 IHC手工染色

组织芯片的vimentin IHC染色：切片脱蜡至水；3% H2O2室温处理10 min；蒸馏水洗，PBS洗2 X 3 min；采用高温高压组织抗原修复方法，枸橼酸盐缓冲液（pH 6. 0)修复抗原2 min；蒸溜水洗，PBS洗2 X 3 min，滴加一抗工作液，室温1 h；PBS洗2 X3 min；滴加Maxvision二抗，室温15 min；PBS 洗 2 X3 min；PBS 洗 3 X3 min；DAB 显色；苏木精 复染；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。选用已知阳性的切片作阳性对照，以PBS替代******抗体作阴性对照。

  1.2.5 全自动IHC染色

严格按Leica-Band全自动免疫组化染色仪SOP文件操作。

2.结果

 2.1 组织芯片的HE染色

自制的组织芯片各点阵排列整齐，薄厚均匀，无移位、脱失现象。HE染色效果良好，细胞形态完整，组织结构显示清晰，色彩鲜艳，核质对比分明，染色结果相比二者无明显差异。

 2.2 组织芯片的IHC染色

自制的组织芯片经手工和 Leica Bond Max两种免疫组化染色后各点阵排列整齐、薄厚均匀，无移位、脱失现象。vimentin胞质着色，定位准确，背景清晰，两种免疫组化结果未见明显差异。

3.讨论

vimentin在免疫组化染色中作为对照的目的是观察组织经甲醛固定后预期抗原表达的敏感性，按固定后抗原损伤的程度来进行分析。vimentin几乎在任何组织中都阳性，在与上皮组织相连接的间质中存在着大量的血管vimentin阳性，如果在同一张切片的间质中出现vimentin染色微弱或部分区域变弱的情况，表明是处理的不当导致抗原破坏，所以在IHC实验中常加入vimentin染色，用于指导观察组织固定后抗原表达敏感性情况。本实验vimentin胞质着色，定位准确、背景清晰，免疫组化染色结果可靠，证明标本组织的细胞抗原性保存良好。

GS试剂不含甲醛、二甲苯等有毒有害物质，运用界面化学及电荷占位原理，对组织标本进行脱水、透明和浸蜡。GS 试剂有较强的固定、脱水、脱脂兼硬化作用，不易导致组织过度收缩，无细胞空泡与核固缩现象产生，处理的组织软硬适中，尤其对脂肪、淋巴组织等组织的处理效果较好，处理较坚韧的子宫肌瘤、皮肤组织也能使其具有较好的柔韧度而有利 于切片。GS试剂对组织渗透性强，能缩短脱水时间，能保持 良好的组织形态学结构，同时能保护细胞膜的完整性，能******限度地保护组织中的抗原和核酸不被破坏、降解或扩散，对DNA和RNA保存较佳，也有利于显示细胞的亚结构。 通过实验，我们体会到用GS无醛固定液固定、GS系列脱水透明套液试剂制作的组织蜡块，经过较长时间放置后切片所做的手工和全自动染色的HE及IHC染色均能取得满意的 结果。