比较GS环保试剂与常规试剂制备的组织样本在荧光定量PCR中的效果

比较GS环保试剂与常规试剂制备的组织样本

在荧光定量PCR中的效果

                                                   

张进华 肖莎  李显筝  齐鲁

南方医科大学病理学系  广州市珠江医院病理科

 

摘自：2011年04期《诊断病理学杂志》

 

应用GS生物组织标本制备液（GS液）制作的石蜡切片提取DNA，进行实时荧光定量PCR技术扩增，并与常规方法制作的石蜡切片进行比较，结果没有大的差别。证实GS液能较好地保存组织中的DNA。

1．材料与方法

1.1材料 取乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌和淋巴瘤组织各12块，每种组织中6块放入4%中性甲醛，6块放入GS液，分别固定1、3、7、15、30和60天；用常规方法方法制成8μm厚石蜡切片。GS液包括环保型无醛固定液和脱水、透明、浸蜡液，由哈尔滨格林标本技术开发有限公司生产。

1.2方法

1.2.1 DNA提取  对分别固定1天和60天的5种组织按下列方法提取：①每种组织切片5张，分别装在2ml Ep管中加入1ml二甲苯，振荡混匀10s，室温全速离心2min，弃上清；加入1ml无水乙醇充分混匀，室温全速离心2min，弃上清；打开Ep管盖，37℃孵育10min，或至残余乙醇全部挥发。②加入500μI TET溶液和30μI蛋白K，37℃水溶过夜。③加入500μI Tris饱和酚，充分振荡，4℃ 13000r/min离心10min，取上清，加入250μI Tris饱和酚，250μI氯仿/异戊醇（24：1），轻轻翻转10min，4℃13000r/min离心10min，取上清，并加入1ml预冷的无水乙醇及3moI/L，NaAc 30μI,充分混匀，-20℃过夜；4℃13000r/min离心15min，弃上清。向Ep管中加入75%乙醇1ml，轻轻翻转3min，4℃13000r/min离心15min，弃上清；室温干燥20min，加入50μI TE缓冲液溶解DNA（-20℃保存），取DNA测量OD值。计算OD260/OD280比值的DNA含量。

1.2.2 PCR反应  用7700型实时荧光定量PCR仪扩增。向PCR反应管中依次加入GS液与4%甲醛处理的5种组织提取的DNA模板100ng（约为105拷贝DNA）10μI建立如下反应体系：Platinum SRBY  Green  qPCR SuperMix-UDG  25μI;正向引物10μMIμI；反向引物10μΜm1μI；不同模板选择荧光素不同1μI/0.1μI；模板基因组DNA≤10μI；DEPC水补至50μI。PCR仪标准循环程序；50℃2min，40个循环；95℃15s，60℃30s。

2．结果

标记有SYBR荧光素与模板乳腺癌基因组DNA混合，标记有vic荧光素与模板结肠癌基因组DNA混合，标记有NED荧光素与模板肺癌基因组DNA混合，标记有ROX荧光素与模板卵巢癌基因组DNA混合，标记有CY5荧光素与模板淋巴瘤基因组DNA混合。完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌和淋巴瘤互补配对的探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在荧光激发波长470nm，荧光发射波长530nm，640nm、710nm、570nm、605nm定光激发下发出荧光，随着循环到20循环，被扩增的乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌和淋巴瘤基因DNA片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化的荧光信号强度转化成线性图谱（图1，2）。

3．讨论

本文主要探讨用GS液固定1、3、7、15、30和60天的组织标本中DNA的保存情况。若固定60天的标本中能扩增出DNA，固定3、7、15和30天的组织标本也应该能扩增出DNA，所以3、7、15和30天没有重复的意义，实验仅取1天和60天比较。实验结果显示，GS液中的固定、脱水、透明试剂在病理组织标本制作中，不但能增加对组织的软化作用，而且渗透性强于甲醛，对组织固定的同时具有脱水、脱脂的兼容性。GS液PH值在6.5-7.0，微偏酸时对保存DNA效果良好。从实验结果看，GS液固定与4%甲醛固定，制片没有多大差异，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究。该系列试剂对工作环境污染少，******了甲醛和二甲苯对人体的毒害作用，是值得大力推广的新型环保试剂。

图1  4%中性甲醛固定60天的乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌和淋巴瘤的线性图谱（从左向右），其基线期、指数增长期、线性增长期和科台期理论扩增成立。说明4%中性甲醛固定60天后仍能较好的保存模板基因  图2 GS液固定60天的5种标本，也能较了地保存模板基因，与4%中性甲醛固定60天的标本大致相同。
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添加时间：2016-04-12 点击量：1298