中性甲醛和无醛固定液短中期固定组织应用GS脱水透明系列试剂组织处理的效果比较评价

中性甲醛和无醛固定液短中期固定组织应用GS脱水透明系列试剂组织处理的效果比较评价

        何金  朱维健  徐毅

       上海市长征医院病理科   

摘自：2011年《全国西安病理技术学术会议暨全军病理技术学术会议》

采用甲醛固定、乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋和切片、苏木精-伊红染色的常规病理技术自创建以来已有一百多年的历史，至今仍在临床病人和医学研究中广泛应用。为了社会的可持续发展，人们也更加认识到环保的重要性，对健康和环境也有了更高的要求。减少或完全替代甲醛和二甲苯毒害试剂的应用，建立一套替代技术取代石蜡包埋切片中毒害试剂的使用是一项意义重大的工作，哈尔滨格林标本技术开发有限公司经过长时间的研究探索，终于开发出了******首创的全新病理技术平台—组织固定脱水系列套装试剂，它是国内******个专业厂家推出的******套环保型套装系列试剂。我们应用GS无醛固定液和10%中性甲醛同时进行短中期固定新鲜肿瘤组织，采用GS脱水透明系列试剂组织处理，然后进行常规HE染色、免疫组化染色和荧光原位杂交检测，将此结果与临床病理传统方法的染色进行综合效果评价。

1. 材料和方法

 1.1 材料

    选择诊断明确的手术切除新鲜标本，乳腺癌4例、肺癌3例、结肠癌2例、、卵巢癌2例。　每例分成12块不小于5mm×5mm×3mm的实质性肿瘤组织，分别装入10%中性甲醛和无醛型固定液中固定，分别于固定后1天（指24小时）、 3天、 7天、15天、30天、60天取出一块组织，放入GS格林组织固定脱水套装试剂的全自动组织处理机进行脱水透明浸蜡，常规包埋蜡块，待全部标本制备完成后，统一切片并同时进行常规HE染色、免疫组化染色和荧光原位杂交检测。

 1.2 试剂

GS无醛生物组织样本固定液、GS生物组织样本制备套液、GS生物组织样本切片染色套液有黑龙江省哈尔滨市格林标本技术开发有限公司提供。免疫组化试剂ER、PR、C-erb-B2、p53、EGFR、ki67、CA-125和即用型快捷免疫组化MaxVision^TM2试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。HER-2、EGFR基因扩增检测试剂盒购自北京金菩嘉医疗科技有限公司。

 1.3 方法

  1.3.1临床病理传统酒精脱水、二甲苯透明、常规浸蜡包埋切片和全自动HE染色

组织经常规10%中******尔马林固定，取材后将组织块放入SHANDON全自动组织处理机，常规处理程序如下，(1) 95%酒精 0:30； (2) 95%酒精  0:30；（3）95%酒精 0:30； (4) 纯酒精 1:00；(5)纯酒精1:00；(6)纯酒精  1:00；(7)纯酒精1:30；(8)纯酒精 2:00；(9)二甲苯 0:30；（10）二甲苯 0:30；（11）蜡A  0:30；（12）蜡B  0:30；(13)蜡C  0:30；(14)蜡D  1:30 。常规石蜡包埋，切片厚4微米。全自动HE染色方法  所有石蜡切片常规烤片后均用Leica AUTO STAINER XL进行全自动HE染色，染色程序如下：（1） 烘烤玻片 2:00min ；(2) 脱蜡二甲苯Ⅰ 5:00 min； (3)脱蜡二甲苯Ⅱ   5:00 min；(4) 脱蜡二甲苯Ⅲ 3:00 min； (5)纯酒精0:30 min； (6)95%酒精Ⅰ 0:30 min；(7)95%酒精Ⅱ0:20 min；(8)70%酒精 0:20 min；(9)流水冲洗 1:30 min；（10）苏木精 4:00 min；（11）流水冲洗 0:45 min；（12） 1%盐酸酒精 0:02 min；（13）流水冲洗 0:45 min；   （14）温水蓝化 0:30 min；（15）伊红染色 0:03 min；（16）纯酒精Ⅰ 0:20 min；（17）纯酒精Ⅱ0:20 min；（18）纯酒精Ⅲ 0:20 min；（19）纯酒精Ⅳ  0:20 min；（20）石炭酸二甲苯 0:45 min；  （21）二甲苯Ⅰ0:20 min；（22） 二甲苯Ⅱ 0:20 min；（23）二甲苯Ⅲ 0:20 min；（24）退出。取出切片后常规中性树胶封片。

  1.3.2   GS格林组织固定脱水套装试剂制片法 

新鲜肿瘤组织放入10%中性甲醛和无醛型固定液，分别于固定后1天（指24小时）、 3天、 7天、15天、30天、60天取出一块组织，将组织块放入装有GS格林组织固定脱水套装试剂的另一台SHANDON全自动组织处理机，组织处理程序如下：（1） 组织固定剂  1:00；（2）组织固定剂 2:00；（3）95%酒精 0:15；（4）纯酒精 0:15；（5）组织脱水剂Ⅰ 0:40；（6） 组织脱水剂Ⅰ 1:20；（7）组织脱水剂Ⅱ 0:40；(8) 组织脱水剂Ⅱ 1:20; (9) 组织透明剂1:00；(10) 组织透明剂 1:30；（11） 浸蜡Ⅰ0:45；(12) 浸蜡Ⅰ  0:50；(13) 浸蜡Ⅱ 0:50；(14) 浸蜡Ⅱ 1:00 。常规石蜡包埋后收集蜡块，待全部标本制备完成后，统一切片并同时进行GS病理切片HE染色、免疫组化染色和荧光原位杂交检测。

  1.3.3   GS病理切片全自动HE染色 

将收集的蜡块统一切片后常规烤片，将GS染色系列套装试剂放入Leica AUTO STAINER XL同时进行GS病理切片全自动HE染色，其染色程序如下：（1） 烘烤玻片 2:00min；(2) 脱蜡Ⅰ（GSA-07） 5:00 min ；(3) 脱蜡Ⅰ（GSA-07）5:00 min ；(4) 脱蜡Ⅰ（GSA-07） 5:00 min；(5)抖动0:10 min；  (6) 脱蜡Ⅱ（GSA-08） 2:00 min；(7) 脱蜡Ⅱ（GSA-08）2:00 min；(8) 脱蜡Ⅱ（GSA-08） 2:00 min；  (9)流水冲洗 2:00 min；（10）苏木素染色液（GSA-09） 4:00 min；（11）流水冲洗 0:45 min；（12） 1%盐酸酒精 0:02 min；（13）流水冲洗 2:00 min； （14）温水蓝化 0:30 min；（15）伊红(GS-10) 染色 1:00 min；（16）流水冲洗 0:05min；（17）除浮染液（GSA-11）0:03min；（18）沥干 2:00min；（19）除水透明液Ⅰ（GSA-11）1:00min；（20）除水透明液Ⅰ（GSA-11）1:00min；（21）除水透明液Ⅰ（GSA-11）1:00min；（22）沥干 2:00min；（23）切片透明液（GSA-13）1:00 min；（24）切片透明液（GSA-13）2:00min；（25）退出。取出切片后常规中性树胶封片。

  1.3.4  自动免疫组化染色机染色

为了使两种固定方法的组织的免疫组化染色更具有可比性，必须尽量减少外在因素的干扰，我们统一将所有标本采用LabVision Antostainer 720自动免疫组化染色机染色。为了便于染色后对切片进行观察分析，我们将同一例用两种固定液固定同一时间的组织在切片时就捞在同一张玻片上，一同进行免疫组化染色。4例乳腺癌组织检测ER、 PR、C-erb-B2；2例结肠癌检测CA-19-9、 p53 ；3例肺癌检测 EGFR、ki67；2例卵巢癌检测CA-125。具体染色方法如下：（1）石蜡切片4微米，常规烤片后GSA-07脱蜡Ⅰ5min×3；(2)GSA-08脱蜡Ⅱ2min；（3）蒸馏水洗；（4）pH6.0柠檬酸盐缓冲液高压锅修复抗原1.5min；（5）蒸馏水洗后将切片放入染色机内进行自动化加样染色，（6）3%过氧化氢10min，PBS洗；（7）分别加上述******抗体孵育60min，PBS洗；（8）新型快捷型酶标鼠/兔聚合物15min，（9）DAB显色5min；（10）苏木素复染2min，常规脱水、透明、中性树胶封片。

  1.3.5  FISH检测

采用荧光原位杂交直接法，选用北京金菩嘉医疗科技有限公司的HER-2、EGFR基因扩增检测试剂盒，对2例乳腺癌的R-A1(1) 、R-B1(1) 、R-A1(60) 、R-B1(60)、R-A4(30)、R-B4(30)  和1例肺癌的F-A3(7)、F-B3(7)    进行FISH检测，操作步骤严格按照说明书进行。结果判断：浸润性乳腺癌细胞核内橘红色HER-2基因荧光信号与17号染色体绿色荧光信号比值＞2.2时为HER-2基因扩增，＜1.8为无扩增，若比值在1.8～2.2之间，则需要再计数30个细胞核中的信号。肺癌EGFR基因扩增主要有三种情况，肿瘤细胞内出现成簇的橘红色扩增信号；橘红色信号与绿色信号比值≥2；EGFR/CSP7比值小于2，但大于或等于4个红色信号（EGFR信号）细胞数占所分析细胞总数的40%以上。

2.  结果

   2.1 HE染色 

A组片用中性甲醛固定、GS生物组织样本制备套液、GS生物组织样本HE切片染色套液制备的HE切片比临床病理传统方法制备的切片染色效果好，细胞核与细胞质染色对比鲜明、结构更清晰。B组片用GS无醛固定液和GS组合试剂制作的切片的染色效果与中性甲醛固定、GS组合试剂制作的切片的染色效果相当，只是组织有些收缩，细胞间隙较明显。（图1 ~12） 

图1  B1104870 乳腺癌传统方法制片HE×20 

图4  B1109183肺肉瘤样癌  传统方法制片HE×20

图10  B1109801卵巢癌传统方法制片HE×20

 

2.2 免疫组化染色结果 

A组片中性甲醛固定、GS生物组织样本制备套液制备的切片所做的各项免疫组化染色要比临床病理传统方法制备的切片免疫组化染色效果好，特别是ER和PR表达的着色强度、阳性细胞数都要比传统方法制片的免疫组化染色着色深、阳性细胞数多，而B组片的免疫组化染色除ER和PR要比A组片弱一些外，其它指标均相差不大。二种固定液短中期固定组织的免疫组化染色无明显差异。（图15 ~30）

A、B组切片与传统方法制片的免疫组化染色比较
分类	编号	病理号	传统方法制片		A组片		B组片
			阳性细胞数	着色强度	阳性 细胞数	着色强度	阳性 细胞数	着色强度
乳腺癌ER	R1	1104870	20%	++	50%	++	20%	+
	R2	1105356	50%	++	90%	+++	70%	++
	R3	1107963		—		—		—
	R4	1109804	30%	+	70%	++	30%	+
乳腺癌PR	R1	1104870	10%	+	30%	+++	5%	+
	R2	1105356	70%	++	90%	+++	50%	++
	R3	1107963		—		—		—
	R4	1109804	50%	++	70%	++	30%	+
乳腺癌C-erbB2	R1	1104870	90%	+++	90%	+++	90%	+++
	R2	1105356	50%	++	70%	++	50%	++
	R3	1107963	70%	+++	70%	+++	70%	+++
	R4	1109804	100%	+++	100%	+++	100%	+++
肺癌EGFR	F1	1105137		—		—		—
	F2	1105455		—		—		—
	F3	1109183		±		±		±
肺癌Ki-67	F1	1105137	30%	+	30%	+	30%	+
	F2	1105455	25%	+	25%	+	25%	+
	F3	1109183	25%	++	40%	+++	40%	++
结肠癌CA19-9	J1	1105136	20%	+	20%	+	20%	+
	J2	1105470	30%	+	30%	+	50%	+
结肠癌P53	J1	1105136		—		—		—
	J2	1105470	40%	+	40%	++	40%	++
卵巢癌CA125	L1	1109524		—		—		—
	L2	1109801		—	20%	++	35%	++

2.3  FISH检测结果  

    2例传统方法制片的乳腺癌和R-A1(1) 、R-B1(1) 、R-A1(60) 、R-B1(60)、R-A4(30)、R-B4(30)的HER-2基因 FISH检测结果均见有呈簇状分布的红色信号， 对1例肺癌和F-A3(7)、F-B3(7) 的EGFR基因进行FISH检测，也均见有呈簇状分布的红色信号。中性甲醛和无醛固定液短中期固定组织后用GS脱水透明系列试剂组织处理的切片进行FISH检测都能得到满意的结果。（图31~41）

3.讨论

进入21世纪的今天，人类的进步和城市的发展已到了一个新的高度，人们对健康和环境也有了更高的要求，为了社会的可持续发展，也更加认识到环保的重要性。减少或完全替代甲醛和二甲苯毒害试剂的应用，建立一套替代技术取代石蜡包埋切片中毒害试剂的使用是一项意义重大的工作，它不仅是我们每个病理工作者的追求的愿望，也是我们对社会应尽的义务。去年初我们刚开始试用格林组织固定脱水套装试剂时，首先做了107标本二种不同脱水方法的HE染色比较，结果发现同一例标本采用二种不同脱水方法的组织块在包埋时就感觉到不一样，常规脱水、透明的组织块脆硬，包埋时易碎裂；格林组织固定脱水套装试剂处理的组织块软硬适中便于包埋。在切片时不论组织大小环保试剂处理的组织块也更好切，特别是肌瘤、皮肤和骨组织等坚硬的组织块比常规脱水的组织块更容易切片。同一例标本二种不同脱水方法的切片同一染色架进行HE染色，格林组织固定脱水套装试剂处理的切片组织红蓝适度、核浆对比分明，色彩鲜艳、结构显示清晰，明显优于传统方法制片的HE染色。这次我们选择乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌共11个病例，进行A组用中性甲醛、B组用无醛固定液短中期固定组织应用GS脱水透明系列试剂组织处理的效果比较评价，每组固定第1、3、7、15、30、60天后，两组一起用GS生物组织样本制备套液制备切片后，再用GS生物组织样本HE切片染色套液进行染色，固定不同时间HE染色均能得到满意的结果，A、B组的HE形态要明显好于该病例用传统方法制备的切片。

11例临床常见的乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌标本，每个病例分为A、B二组分别用中性甲醛和GS无醛固定液进行短、中期固定效果比较，共132个组织蜡块，用ER、 PR、C-erb-B2、 CA-19-9、 p53 、 EGFR、ki67、 CA-125分别做了264个标记的免疫组化染色，并与临床传统方法制片的免疫组化染色进行对比分析。我们发现用中性甲醛固定、GS生物组织样本制备套液制备的切片所做的各个指标的免疫组化染色结果要明显优于传统方法制片做到免疫组化染色；GS无醛固定、GS格林组织固定脱水套液制备的切片所做的的免疫组化染色，除ER、PR结果比传统方法制片免疫组化染色稍弱
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添加时间：2016-04-07 点击量：1347