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病理论坛在线咨询GS组织样本与常规组织处理提取DNA的效果比较
GS组织样本与常规组织处理提取DNA的效果比较
张进华 王爽 齐鲁
广州南方医科大学病理系
近20年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了更多新资料。医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。Goelz（1985）和Dubeau 等（1986）成功地从蜡块中提取出高质量的DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要，结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻组织和细胞的历史，而且可以广泛地应用于大宗病例的回顾性研究，对肿瘤发生的分子机制的探讨、诊断与鉴别诊断研究有重要意义。
近年来随着人们环保意识的提高，格林GS标本推出的组织固定脱水系列套装试剂，减少或完全替代甲醛和苯系化学毒害试剂。我们用GS标本系装试剂列套，制作的石错切片提取DNA。PCR扩增、琼脂糖电泳结果分析。并与常规固定脱水包埋作的石错切片进行比较没有差别。格林GS标本推出的组织固定脱水系列套装试剂能较好保存病理组织中的DNA。主要步骤：取结肠癌、卵巢粘液腺癌，移行细胞癌，肝癌、胰腺癌、鳞状细胞癌、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢非粘液癌各6块。GS标本系装试剂列套处理。常规甲醛乙醇处理各6块，方法如下:
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组织固定液 |
1000ml/4000ml |
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GSB—01 |
组织固定液 |
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GSB—02 |
组织脱水液Ⅰ |
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GSB—03 |
组织脱水液Ⅱ |
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GSB—04 |
组织透明液 |
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GSB—05 |
组织浸蜡液Ⅰ |
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GSB—06 |
组织浸蜡液Ⅱ |
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GSA—01 |
组织固定液 |
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GSA—02 |
组织脱水液Ⅰ |
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GSA—03 |
组织脱水液Ⅱ |
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GSA—04 |
组织透明液 |
GS组织样本制备程序
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序号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
→ |
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步骤 |
固定液 |
脱水液Ⅰ |
脱水液Ⅱ |
透明液 |
浸蜡液Ⅰ |
浸蜡液Ⅱ |
组织块 |
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产品 编号 |
GSA-01 GSB-01 |
GSA-02 GSB-02 |
GSA-03 GSB-03 |
GSA-04 GSB-04 |
GSA-05 |
GSA-06 |
包埋 |
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手工 用时 |
过夜 |
1h30min |
1h30min |
2h30min |
2h30min |
过夜 |
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DNA提取方法的主要步骤：
格林GS标本推出的组织固定脱水系列套装试剂与常规处理的上述标本分别按下列方法提取：
1、每种蜡块切 8微米厚的石蜡切片5张装在2mLEp管中加入1mL二甲苯，振荡混匀10s，室温全速离心2min，弃上清，加入1mL无水乙醇，充分混匀，室温全速离心2min，弃上清。打开Ep管盖，37℃孵育10min，或直到残余乙醇全部挥发。
2、在已脱蜡的组织切片管内加入500 μLTET溶液和30μL蛋白酶K，37℃水浴过夜。
3、在已消化过夜的组织中加入500μL Tris-饱和酚，充分振荡，4℃ 13 000 r/min离心10min，取上清，加入250μLTris-饱和酚、250 μL氯仿/异戊醇(24∶1)，轻轻翻转10 min，4 ℃ 13 000r/min离心10 min，取上清并加入1mL预冷的无水乙醇及30μL3mol/L NaAc，充分混匀，-20℃过夜。4℃13 000 r/min离心15 min，弃上清。向Ep管中加入1mL体积分数为75%的乙醇，轻轻翻转3min，4℃ 13000r/min离心15min，弃上清，室温干燥20min或直至酒精完全挥发，加入50μL TE缓冲液溶解DNA(-20 ℃保存) 取的DNA 经OD值测量。计算OD260 /OD280比
PCR反应步骤：
格林GS标本推出的组织固定脱水系列套装试剂与常规处理的上述标本分别按下列方法扩增。（1）向PCR反应管中依次加入格林GS标本推出的组织固定脱水系列套装试剂与常规处理的结肠癌、卵巢粘液腺癌，移行细胞癌，肝癌、胰腺癌、鳞状细胞癌、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢非粘液癌提取的DNA模板 100ng (约为105拷贝DNA)引物(3'→5'，5'→3')各 2μl
10μmol/L (终浓度为0.4μmol/L)dNTP 2μl 5mmol/L (终浓度为0.2μmol/L)10×PCR缓冲液 5μl 1/10体积 (终浓度为1×)MgCl2
3μl 25mmol/L (终浓度为1.5mmol/L)Taq DNA聚合酶 0.5μl (终浓度约1～5U/μl)ddH2O 补到终体积为50μl，混匀后，离心15 s使反应成分沉于管底。(2) 加入矿物油30μl（2～3滴），以避免反应液蒸发，然后将反应管置于95℃（变性）5min。(3) PCR的循环程序一般为：94℃～96℃变性30s， 50℃～55℃退火30～60s，72℃延伸(1kb/1～2min)，循环25～30次。末次循环结束后，将反应管置于72℃温育5min，以确保充分延伸保存 4℃ 。
4、将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
（1）琼脂糖电泳
格林GS标本推出的组织固定脱水系列套装试剂与常规处理的上述标本分别按下列方法扩增试剂：
5ⅹTBE溶液：54gTris，27.5g硼酸，4.6g EDTANa2溶于去离子水中，定容至1L。电泳时10倍稀释使用。
5ⅹ上样缓冲液：用5×TBE溶液配制0.5%溴酚蓝，再加等体积甘油混匀。
溴化乙锭溶液：5mg/ml的溴化乙锭，避光保存。
0.8%琼脂糖，用1×TBE溶液配制。
（2）器材
电泳仪、水平电泳槽、紫外分析仪。
操作方法：
琼脂糖溶液的制备：配0.7%琼脂糖，在沸水浴中煮沸直到完全溶解；将溶液冷却到约50~60℃，加入溴化乙锭到终浓度为0.5ug/ml。
将琼脂糖溶液倒入电泳支架上，放上梳子，梳子须离开电泳支架底部1mm左右。待凝胶凝聚后，小心拔去梳子，将支架放入装有电极缓冲液的电泳槽中，电极缓冲液应淹没过胶。
电泳
取薄膜，滴加上样缓冲液和格林GS标本推出的组织固定脱水系列套装试剂与常规处理的结肠癌、卵巢粘液腺癌，移行细胞癌，肝癌、胰腺癌、鳞状细胞癌、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢非粘液癌提取的DNA样品10ul，混匀，用微量移液器加入样品槽中。点样端朝负极，通电。电压为10v/cm。至溴酚蓝移到距边1cm处，取出凝胶，紫外灯下检测。
结果
PCR扩增DNA片段只是一个重要手段，扩增片段的检测和分析才是目的，琼脂糖凝胶电泳可鉴定扩增产物的大小和特异性与敏感性；经格林GS标本推出的组织固定脱水系列套装试剂制备的1、结肠癌 2、卵巢粘液腺癌 3、移行细胞癌 4、肝癌 5、胰腺癌 6、鳞状细胞癌 7、乳腺癌 8、子宫内膜癌 9、卵巢非粘液癌。
结果：
1 2 3 4 5 6 7 8 9
结果：
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讨论
格林标本—新一代环保型病理组织标本固定脱水透明试剂在病理组织标本制作中不但能增加对组织软化，而且渗透性更强。对组织固定的同时，兼有脱水、脱脂的兼容性。pH值在6.5～7.0，微偏酸，对保存DNA效果很好。从实验结果看和常规制片没有差异。完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究。医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。格林GS标本推出的组织固定脱水系列套装试剂。能较好应用于病理组织标本；而且环保。对工作环境污染少。减少或完全替代甲醛和苯的毒害。是值得推广的环保试剂。
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